一,、分析方法的種類
1. 一點(diǎn)法 又稱為終點(diǎn)法,。指加入標(biāo)本和試劑后,,當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定階段時(shí)(或終點(diǎn))測定吸光度值計(jì)算待測物質(zhì)濃度的方法,。主要用于總蛋白,白蛋白,,血糖,,甘油三酯和膽固醇等項(xiàng)目測定。
2. 二點(diǎn)法 在反應(yīng)過程中測定兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度(A1,、A2),,利用二者差值(A1—A2)計(jì)算待測物質(zhì)濃度的方法。二點(diǎn)法又稱為二點(diǎn)終點(diǎn)法,,使用雙試劑進(jìn)行分析時(shí)多彩二點(diǎn)法,,加入標(biāo)本和第一試劑測定一次吸光度,,加入第二試劑(啟動試劑)待反應(yīng)完成時(shí)測定另一次吸光度,兩者的差值可消除標(biāo)本內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,。主要用于總膽紅素,、直接膽紅素、甘油三酯和膽固醇等項(xiàng)目的測定,。
3. 二點(diǎn)速率法 在反應(yīng)過程中選擇適當(dāng)兩點(diǎn)測定其吸光度,計(jì)算出單位時(shí)間(常為分鐘)內(nèi)吸光度的變化量,,通過吸光度的變化量計(jì)算待測物質(zhì)濃度的方法,。二點(diǎn)速率分析法主要用于Jaffe法測定肌酐。
4. 速率A法 根據(jù)酶促反應(yīng)的特點(diǎn),,當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼?,?dāng)酶促反應(yīng)達(dá)到最大時(shí),單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量維持不變,,即單位時(shí)間內(nèi)吸光度變化值不變,,在酶促反應(yīng)的零級反應(yīng)區(qū)內(nèi)選取兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),計(jì)算出每分鐘吸光度變化,,吸光度變化值同酶活性大小成正比,。速率A法常應(yīng)用于酶活性的測定。
5. 其它 不常用的分析方法有三波長法和速率B法,,主要用于在一個(gè)反應(yīng)杯中進(jìn)行兩個(gè)物質(zhì)測定,。
以上各種分析可同時(shí)選用雙波長法。雙波長法指在測定時(shí)選擇主波長和副波長,,主波長用于待測物質(zhì)的測定,,而副波長用于消除可能產(chǎn)生的干擾。副波長選擇原則為干擾物質(zhì)在主波長和副波長的光吸收相等,,而等測物質(zhì)有最小的吸光度,,兩波長不能相隔太近,一般副波長大開主波長,。
二,、自動生化分析儀的校準(zhǔn)方法
1. K因素法 又稱為標(biāo)準(zhǔn)化法或線性法,當(dāng)物質(zhì)的濃度和吸光度成比例變化時(shí)選用該法,。原理是用校準(zhǔn)品進(jìn)行反應(yīng),,測定吸光度的大小或變化量,根據(jù)朗伯—比爾定理(濃度=因素*吸光度)計(jì)算出因素(K)的大小,,測定待測物質(zhì)吸光度,,利用因素K可計(jì)算出待測物質(zhì)濃度大小和活性大小。K因素法是應(yīng)用最廣泛的校準(zhǔn)方法,,用于常規(guī)生化檢驗(yàn)項(xiàng)目的濃度或活性的分析,。
2. 非線性法 又稱為曲線擬合法,,當(dāng)物質(zhì)的濃度和吸光度不成比例變化時(shí)選用該法。其原理是使用多個(gè)(3—6)濃度的校準(zhǔn)品,,在選定波長測定其吸光度值,,利用濃度和吸光度之間的關(guān)系繪制非線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。生化分析儀多采用Logit-log等方法進(jìn)行擬合計(jì)算出曲線各常數(shù),。非線性法適用于免疫分析方法,,如C-反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子,、抗“O”和酸性糖蛋白等的測定,。
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